Page 29 - รายงาน ผลของการใช้ผลิตภัณฑ์ชีวภาพเพื่อเร่งการย่อยสลายตอซังข้าวโพดเลี้ยงสัตว์ Effect of using biological products for accelerating the degradation of maize stubble

ห้องสมุดกรมพัฒนาที่ดิน

23

1.1.1) เตรียมต้นตอเชื้อราสายพันธุ์ Corynascus verrucosus 23 มีประสิทธิภาพใน
การผลิตเอนไซม์เซลลูเลสได้สูง และทนต่ออุณหภูมิสูงที่ 45 องศาเซลเซียส ในกระบวนการย่อยสลายได้ดี
เพาะเลี้ยงเป็นต้นตอเชื้อบนอาหารแข็ง การเตรียมอาหารวุ้นสูตร PDA (potato dextrose agar) (Atlas, 1997)
ละลาย PDA 39 กรัม ในน้ำกลั่นปริมาตร 1 ลิตร แล้วนำไปนำไปนึ่งฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เป็น

เวลา 15 นาที ทิ้งไว้ให้เย็นลงประมาณ 50 - 60 องศาเซลเซียส ก่อนเทใส่จานเลี้ยงเชื้อประมาณ 8 มิลลิลิตร
เลี้ยงเชื้อบนผิวหน้าอาหารเลี้ยงเชื้อเป็นเวลา 7 วัน แล้วเก็บเชื้อบริสุทธิ์ไว้บนอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดเดิมเพื่อใช้
เป็นต้นตอเชื้อ (stock culture) ในการทดสอบต่อไป
1.1.2) การเตรียมกล้าเชื้อราจากข้อ 1.1.1) เลี้ยงเชื้อบนอาหารแข็ง การเตรียมอาหาร

วุ้นสูตร PDA ละลาย PDA 39 กรัม ในน้ำกลั่นปริมาตร 1 ลิตร แล้วนำไปนึ่งฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121 องศา
เซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที ทิ้งไว้ให้เย็นลงประมาณ 50 - 60 องศาเซลเซียส ก่อนเทใส่จานเลี้ยงเชื้อ จานละ
ประมาณ 8 มิลลิลิตร เลี้ยงเชื้อบนผิวหน้าอาหารเลี้ยงเชื้อเป็นเวลา 7 วัน เชื้อเจริญเต็มจานเลี้ยงเชื้อ
1.1.3) การเตรียมวัสดุเลี้ยงเชื้อราชนิดแข็งที่มีประสิทธิภาพการเพิ่มปริมาณเชื้อราและ

เอนไซม์เซลลูเลส คัดเลือกวัสดุเลี้ยงเชื้อราใช้เป็นแหล่งอาหาร 3 ชนิด ได้แก่ ข้าวสาลี ข้าวโอ๊ต และข้าวเสาไห้
1.1.4) การเพาะเลี้ยงเชื้อราบนอาหารแข็งแบบ solid-state fermentation (SSF)
(Gao et al., 2013) โดยการศึกษาสภาวะการเลี้ยงในถาด ดังนี้

(1) เตรียมละลายสารชักนำ ประกอบด้วยสารเซลลาไบโอส 100 มิลลิกรัมต่อ
ลิตร และสารแล็กโทส 10 เปอร์เซ็นต์น้ำหนักโดยปริมาตร ในน้ำ 1 ลิตร ผสมให้เข้ากัน นำไปนึ่งฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ
121 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที ทิ้งไว้ให้เย็น (ดัดแปลงจาก Kurasawa et al., 1992; Morikawa et al.,
1995)
(2) เตรียมแหล่งอาหารเลี้ยงเชื้อ นำข้าวสาลี ข้าวโอ๊ต และข้าวเสาไห้ แต่ละชนิด

อย่างละ 40 กรัม ใส่ในขวดรูปชมพูขนาด 500 มิลลิลิตร ใส่สารชักนำจากข้อ (1) ปริมาตร 40 มิลลิลิตร เขย่าให้
เข้ากันแล้วนำไปนึ่งฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตั้งทิ้งไว้ให้เย็น แล้วเทลงใน
ถาดสแตนเลสขนาด 8 x 12 นิ้ว ทำการเกลี่ยวัสดุให้แยกออกจากกัน

(3) นำกล้าเชื้อสายพันธุ์ Corynascus verrucosus 23 ที่เพาะเลี้ยงบนอาหาร
แข็ง PDA ตัดเชื้อเฉพาะสายเส้นใย โดยใช้หัวเจาะ cork - borers เบอร์ 3 ขนาด 5 มิลลิเมตร จำนวน 2 ชิ้น มา
ใส่ในถาด ปิดถาดด้วยผ้าขาวบาง บ่มที่อุณหภูมิ 30 - 35 องศาเซลเซียส จากนั้นเกลี่ยตัวอย่างทุกเวลา 24
ชั่วโมง เก็บตัวอย่างวิเคราะห์ข้อมูลหลังจากเลี้ยงเชื้อ 3 วัน 7 วัน และ 14 วัน

1.1.5) การเก็บข้อมูลและวิเคราะห์ตัวอย่าง
(1) การวิเคราะห์ปริมาณเชื้อรา ด้วยวิธี Microbiological method ตรวจนับ
จำนวนจุลินทรีย์ โดยวิธี dilution plate count บนอาหาร Martin’s streptomycin medium (MA)
(Johnson and Curl, 1972) ประกอบด้วย KH2PO4 1.0 กรัม MgSO4.7H2O 0.5 กรัม peptone 5.0 กรัม

dextrose 10.0 กรัม rose bengal 0.033 กรัม streptomycin 1.0 กรัม agar 15.0 กรัม และน้ำกลั่น 1,000
มิลลิลิตร บ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3 วัน นับปริมาณเชื้อที่ขึ้นในอาหารเลี้ยงเชื้อ เก็บตัวอย่างวิเคราะห์ข้อมูล
หลังจากเลี้ยงเชื้อ 3 วัน 7 วัน และ 14 วัน
(2) การวิเคราะห์ปริมาณเอนไซม์เซลลูเลส เก็บตัวอย่างวิเคราะห์ข้อมูลหลังจาก

เลี้ยงเชื้อ 3 วัน 7 วัน และ 14 วัน มีขั้นตอนดังนี้