Page 8 - การคัดเลือกจุลินทรีย์ดินที่มีประสิทธิภาพควบคุมไส้เดือนฝอยรากปมในพืช Effective selection of microbial against root knot nematode

ห้องสมุดกรมพัฒนาที่ดิน

1) การแยกจุลินทรีย์

ท าการแยกจุลินทรีย์ดิน โดยแยกเป็นแบคทีเรียและรา ใช้วิธี Spread plate ชั่งตัวอย่างดิน 1
-5
-3
กรัม ละลายในน้ ากลั่นปลอดเชื้อมาเจือจางให้มีระดับความเข้มข้นที่เหมาะสม (10 -10 ) แล้ว Spread
๐
ลงบนอาหาร Nutrient agar (NA) บ่มที่อุณหภูมิ 30 C เป็นเวลา 3 วัน และ subculture จนได้เชื้อ
บริสุทธิ์และเก็บรักษาเพื่อศึกษาขั้นตอนต่อไป

2) การทดสอบการผลิตเอนไซม์โปรติเอสและไคติเนส
2.1) น าเชื้อบริสุทธิ์มาทดสอบโดยใช้เข็มเขี่ยปลายแหลมปลอดเชื้อเขี่ยโคโลนีเดี่ยวของเชื้อ

แบคทีเรียและเชื้อรา ที่คัดแยกได้มาแตะบนอาหารเลี้ยงเชื้อ Skim milk agar และ Chitin selective
๐
๐
agar บ่มที่อุณหภูมิ 30 C และ 45 C เป็นเวลา 3-7 วัน สังเกตวงใส (clear zone) ที่ปรากฏบนผิวหน้า
อาหารและ วัดเส้นผ่านศูนย์กลาง (Ø) ของวงใส คัดเลือกจุลินทรีย์เพื่อน าไปทดสอบในขั้นตอนต่อไป

2.2) การวิเคราะห์ปริมาณเอนไซม์โปรทีเอส และไคติเนส

วิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์ protease โดยน าน้ าเลี้ยงเชื้อ จากข้อ 1. ปริมาณ 1 มล.
ใส่หลอดทดลอง ปริมาตรหลอดละ 1 มล. ทุก ๆ หลอดเติมสารละลายเคซีน (casein) เข้มข้น 1 % ใน 0.1

molar photphate buffer pH 7.0 จ านวน 1 มล. เขย่าให้เข้ากันดี บ่มที่อุณหภูมิ 37 °C เพื่อให้เกิดปฏิกิริยา

นาน 1 ชั่วโมง แล้วหยุดปฏิกิริยาด้วยสารละลาย Trichloroacetic acid (TCA) เข้มข้น 10 % จ านวน 3 มล.
ผสมให้เข้ากันแล้วตั้งทิ้งไว้ให้ตกตะกอนสมบูรณ์ที่อุณหภูมิ 37 °C นาน 20 นาที ดูดส่วนใสไปหมุนเหวี่ยงที่

ความเร็ว 12,000 รอบ/นาที นาน 10 นาที น าส่วนใสที่ได้ปริมาตร 0.5 มล. มาเติม 0.4 molar Na CO
3
2
จ านวน 2.5 มล. ผสมให้เข้ากันแล้วเติม 1 Folin Ci°Calteu reagent จ านวน 0.5 มล. ผสมให้เข้ากันอีกครั้ง
ตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิ 37 °C นาน 10 นาที แล้วน าไปวัดค่าดูดกลืนแสงด้วยเครื่อง spectrophotometer ที่ความ

ยาวคลื่น 660 nm ดัดแปลงตามวิธีของ Yang และ Wang (1999) ค่าดูดกลืนแสงที่ได้น าไปอ่านค่าเพื่อแปลง
เป็นปริมาณกรดอะมิโน ที่ถูกย่อยออกจาก casein น าค่าไปค านวณกิจกรรมของเอนไซม์ โดยการวิเคราะห์

ปริมาณกรดอะมิโน (tyrosine equivalent) ที่ถูกย่อยออกจากเคซีน กิจกรรมของเอนไซม์จ าเพาะ (specific
activity) 1 หน่วย (unit) ประเมินจากปริมาณกรดอะมิโน (tyrosine equivalent) 1 umol ที่ถูกย่อยจาก

เคซีนต่อมิลลิกรัมโปรตีนใน 1 ชั่วโมงใน reaction mixture

การวิเคราะห์ปริมาณเอนไซม์ไคติเนส น าน้ าเลี้ยงเชื้อ จากข้อ 1. จ านวน 0.1 มล.
บ่มร่วมกับสารละลาย colloidal chitin 1 เปอร์เซ็นต์ ใน 0.1 molar acetate buffer pH 5.0 จ านวน 0.9 มล.

ที่อุณหภูมิ 37 °C นาน 1 ชม. (ดัดแปลงจาก Saksirirat and Hoppe, 1991) ปริมาตร 0.1 มล. เขย่าให้เข้ากัน

ด้วย Vortex mixer หยุดปฏิกิริยาโดยน าหลอดไปต้มในน้ าเดือดนาน 20 นาที น าสารละลายที่ได้ไปวิเคราะห์
น้ าตาลรีดิวซ์ตามวิธีของ Somogyi (1952) วัดค่าการดูดกลืนแสงด้วย spectrophotometer ที่ความยาวคลื่น

520 nm ซึ่งกิจกรรมของเอนไซม์ 1 หน่วย (unit) ประเมินจากปริมาณน้ าตาลรีดิวซ์ (N-acetylglucosamine

equivalent) คิดเป็น 1 umol ที่ถูกย่อยออกจาก colloidal chitin ใน 1 ชม./มก.โปรตีนใน reaction mixtu
โดยเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐานของ N-acetylglucosamine