Page 9 - การคัดเลือกจุลินทรีย์ดินที่มีประสิทธิภาพควบคุมไส้เดือนฝอยรากปมในพืช Effective selection of microbial against root knot nematode

ห้องสมุดกรมพัฒนาที่ดิน

3) การทดสอบการควบคุมไส้เดือนฝอยรากปม

การทดสอบกิจกรรมการควบคุมไส้เดือนฝอย โดยวิธี bioassay น าไส้เดือนฝอยจ านวน 200 ตัว
ใส่ลงในส่วนใสจากการเลี้ยงเชื้อ 300 ul ใส่ลง 1.5 ml Eppendorf tube และใส่ สารปฏิชีวนะ 2 ชนิด คือ

anpicillin 50 ug/mlและ kanamycin 30 ug/ml น าไปบ่มที่อุณหภูมิห้อง 2-10 ชั่วโมง น าไปนับจ านวน
ไส้เดือนฝอยที่ตายภายใต้กล้องจุลทรรศน์ และมี น้ าเปล่าเป็นต ารับควบคุม

3. การจ าแนกเชื้อจุลินทรีย์
คัดเลือกจุลินทรีย์ที่มีประสิทธิภาพในการควบคุมไส้เดือนฝอย 5 ไอโซเลท มาจ าแนกชนิดด้วย

เทคนิคทางชีวโมเลกุล โดยสกัดดีเอ็นเอแบคทีเรียที่เลี้ยงในอาหารเหลวข้ามคืนปริมาตร 2 มิลลิลิตรใส่

หลอด microcentrifuge tube น ามาหมุนเหวี่ยงที่ 13,000 รอบต่อนาที นาน 2 นาที เทส่วนใสทิ้ง
จากนั้นเติม Nuclei lysis solution 600 ไมโครลิตร น าไปบ่มที่อุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียส นาน 5 นาที

จากนั้นเติม RNase solution 3 ไมโครลิตร ผสมให้เข้ากัน น าไปบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสนาน 15-60 นาที

เติม Protein precipitation solution 200 ไมโครลิตร ผสมให้เข้ากันบ่มบนน้ าแข็งนาน 5 นาที น ามา
หมุนเหวี่ยงที่ 13,000 รอบต่อนาที นาน 3 นาที ดูดส่วนใส ใส่หลอดใหม่เติม isopropanol 600

ไมโครลิตร ผสมให้เข้ากัน น ามาหมุนเหวี่ยงที่ 13,000 รอบต่อนาที นาน 3 นาที ดูดส่วนใสทิ้งล้างตะกอน

ด้วย 70% Ethanol 600 ไมโครลิตร ผสมให้เข้ากัน น าไปหมุนเหวี่ยงที่ 13,000 รอบต่อนาที นาน 2 นาที
เทน้ าใสทิ้ง ปล่อยให้ตะกอนแห้ง แล้วละลายตะกอนดีเอ็นเอด้วย Rehydration solution 100 ไมโครลิตร

บ่มที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส นาน 1 ชั่วโมง (Wizard Genomic DNA Purification Kit)
ปฏิกิริยา PCR ในปริมาตรรวม 50 ไมโครลิตรประกอบด้วยดีเอ็นเอ 1 ไมโครลิตร , 0.25 mM

dNTPs (dATP,dCTP,dTTP,dGTP) 0.40 ไมโครลิตร, 1X buffer, 1.5 mM MgCl , 0.5 M
2
universal primer 16S rDNA (16S 9f: GAG TTT GAT CCT GGC TCA G และ16S 1512 r: ACG GCT
ACC TTG TTA CGA CTT) และ 2.5 unit Taq DNA Polymerase ปฏิกิริยาสังเคราะห์ดีเอ็นเอท าที่

initiation denaturation 94 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที denaturing 94 องศาเซลเซียส 1 วินาที
annealing 55 องศาเซลเซียส 2 นาที และ extension 72 องศาเซลเซียส 3 นาที จ านวน 30 รอบ และ

ตามด้วยอุณหภูมิที่ 72 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที โดยใช้เครื่อง DNA thermal cycle ผลผลิต

PCR ที่ได้ 5 ไมโครลิตร น ามาตรวจสอบด้วยเทคนิค gel electrophoresis บน 1.0% agarose gel ใน
1X TAE buffer และผลผลิต PCR อีกส่วนน าส่งวิเคราะห์ล าดับเบส

4. การทดสอบประสิทธิภาพการควบคุมไส้เดือนฝอยรากปมมะเขือเทศในสภาพโรงเรือนทดลอง

1) การวางแผนการทดลอง วางแผนการทดลองแบบ CRD ประกอบด้วย 6 ต ารับทดลอง จ านวน
3 ซ้ า ดังนี้

ต ารับที่ 1 ควบคุม (ไม่ใส่ไส้เดือนฝอยรากปม และจุลินทรีย์ควบคุมไส้เดือนฝอยรากปม)

ต ารับที่ 2 ใส่ไส้เดือยฝอยรากปม (ไม่ใส่จุลินทรีย์ควบคุมไส้เดือนฝอยรากปม)
ต ารับที่ 3 ใส่สารเคมีควบคุมไส้เดือนฝอยรากปม

ต ารับที่ 4 ใส่แบคทีเรียควบคุมไส้เดือนฝอยรากปม isolate ที่ 1 (NW7-A3)