Page 95 - เอกสารประกอบการประชุมวิชาการกรมพัฒนาที่ดิน ปี2560 วิชาการงานพัฒนาที่ดิน ขับเคลื่อนคุณภาพชีวิตเกษตรกรสู่ความยั่งยืน : ระหว่างวันที่ 19-21 กรกฎาคม 2560 ณ โรงแรมสยามออเรียนทัล อำเภอหาดใหญ่ จังหวัดสงขลา

ห้องสมุดกรมพัฒนาที่ดิน

ประชุมวิชาการกรมพัฒนาที่ดิน ปี 2560 “วิชาการงานพัฒนาที่ดิน ขับเคลื่อนคุณภาพชีวิตเกษตรกรสู่ความยั่งยืน” วันที่ 19 - 21 กรกฎาคม 2560

2. การตรวจสอบอะโซสไปริลลัมด้วยเทคนิคทางชีวโมเลกุล และการจ าแนกชนิดด้วยวิธี 16S rRNA gene
sequence analysis

สกัดดีเอ็นเอของแบคทีเรียที่คัดแยกได้ โดยน าโคโลนีของแบคทีเรียมาละลายในน้ ากลั่นนึ่งฆ่าเชื้อ 50

ไมโครลิตร บ่มที่อุณหภูมิ 100 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 5 นาที น าดีเอ็นเอที่ได้มาตรวจสอบด้วยเทคนิค
polymerase chain reaction (PCR) โดยใช้ไพรเมอร์ที่จ าเพาะกับจีนัสอะโซสไปริลลัมตามวิธีการของ

Lin et al. (2011) และน าผลผลิต PCR มาตรวจสอบด้วยเทคนิค gel electrophoresis บน 1.5 % agarose gel
ใน 1X TAE buffer จากนั้นน าตัวอย่างที่พบแถบดีเอ็นเอมาจ าแนกชนิดด้วยวิธี 16S rRNA gene sequence

analysis โดยการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในส่วน 16s rRNA gene ด้วยปฏิกิริยา PCR โดยใช้ universal primer

ผลผลิต PCR ที่ได้น ามาตรวจสอบด้วยเทคนิค gel electrophoresis บน 1.0 % agarose gel ใน 1X TAE
buffer และผลผลิต PCR ส่วนที่เหลือน าไปวิเคราะห์ล าดับเบสด้วยThermo sequence fluorescent labeled

primer cycle sequencing kit (Amercham pharmacia biotech) ที่บริษัท Macrogen (Korea) จากนั้น

น าล าดับเบสที่ได้มาเปรียบเทียบล าดับเบสโดยใช้โปรแกรม Nucleotide BLAST (http://blast.ncbi.nlm.
nih.gov/)

3. การทดสอบประสิทธิภาพการตรึงไนโตรเจน การผลิตฮอร์โมนออกซิน จิบเบอร์เรลลินและสารไซเดอโรฟอร์
3.1 การทดสอบกิจกรรมการตรึงไนโตรเจน และตรวจสอบยีน nifH

ทดสอบกิจกรรมการตรึงไนโตรเจนด้วยวิธี acetylene reduction technique (ARA) ตามวิธีการ

ของ Boddey (1987) โดยน าอะโซสไปริลลัมแต่ละไอโซเลตที่เลี้ยงในอาหารเหลวเป็นเวลา 48 ชั่วโมง ปรับ
ความขุ่นให้มีค่า OD เท่ากับ 1.0 (Bashan and Levanony, 1985) มาเลี้ยงในอาหาร N-free semi-solid
540
malate medium 100 มิลลิลิตร ที่บรรจุใน flask ขนาด 250 มิลลิลิตร เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นแลกเปลี่ยน

แก๊สภายใน flask กับแก๊สอะเซทีลีน บ่มทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง แล้วน าแก๊สที่ได้มาวัดค่าการ
ตรึงไนโตรเจนด้วยเครื่อง GC (Gas Chromatography) โดยใช้ Flame Ionization Detector (FID) และ

ตรวจสอบยีนที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการตรึงไนโตรเจน โดยตรวจสอบยีน nifH ด้วยปฏิกิริยา PCR ตามรายงาน

ของ Poly et al. (2001)
3.2 การทดสอบประสิทธิภาพการสร้างฮอร์โมนออกซิน และจิบเบอร์เรลลิน

วิเคราะห์ปริมาณฮอร์โมนออกซิน (IAA) ด้วย colorimetric technique โดยเลี้ยงเชื้อในอาหาร
เหลว NFB ที่เติม Tryptophan 100 มิลลิกรัมต่อลิตร น าไปบ่มที่ความเร็ว 120 รอบต่อนาที อุณหภูมิ 30

องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นน ามาปั่นเหวี่ยงด้วยความเร็วรอบ 10,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา
15 นาที น าส่วนใสมาวัดปริมาณการผลิต IAA ตามวิธีการของ Akbari et al. (2007) ด้วยเครื่องสเปกโตร

โฟโตมิเตอร์ ที่ความยาวคลื่น 530 นาโนเมตร โดยเปรียบเทียบกับความเข้มข้นของสารละลาย IAA มาตรฐาน

วิเคราะห์ปริมาณจิบเบอร์เรลลิน (gibberellic acid; GA ) ตามวิธีของ Holbrook et al. (1961)
3
โดยน าส่วนใสของตัวอย่างปริมาตร 15 มิลลิลิตร เติม zinc acetate reagent (zinc acetate 21.9 กรัมและ

glacial acetic acid ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ปรับปริมาตรให้เป็น 100 มิลลิลิตรด้วยน้ ากลั่น) ปริมาตร 2

มิลลิลิตร ตั้งทิ้งไว้ 2 นาที จากนั้นเติม potassium ferrocyanide (10.6 เปอร์เซ็นต์ในน้ ากลั่น) ปริมาตร 2

72